Главная   Проекты   Лазерные технологии   Масс-спектрометрия биологических жидкостей

Масс-спектрометрия биологических жидкостей

Разработка технологии масс-спектрометрического экспресс-анализа жидких биологических проб и выпуск опытных образцов лазерного масс-спектрометра. Работа проводится при поддержке Федерального агентства по науке и инновациям. Государственный контракт №02.522.12.2012 от 01 октября 2009 г.

(Институт общей физики им. А.М.Прохорова РАН Институт аналитического приборостроения РАН ООО "Лаборатория оптико-электронных приборов" ООО "Инлайф" ЗАО "Аксиома-Сервис")

Актуальность проекта

Одной из основных задач, стоящих перед современной медициной, является проведение терапевтического лекарственного мониторинга в целях обеспечения оптимальной концентрации лекарственного средства в месте его действия. В первую очередь это касается антибиотиков, антиаритмических препаратов, антиконвульсантов и других препаратов, имеющих узкий терапевтический коридор (разницу между средней терапевтической и токсической дозами).

В России терапевтическому лекарственному мониторингу подлежат более пятидесяти веществ (приказ Минздрава России от 21 февраля 2000г. N 64). Знание терапевтического коридора во многих случаях облегчает задачи врача в выборе оптимальных схем применения лекарственного средства.

Простое измерение значений концентраций в крови пациента не всегда обеспечивает успешный результат, даже если речь идет о препарате, терапевтические рамки которого хорошо известны и можно по двум-трем измерениям рассчитать необходимую дозировку и интервалы дозирования. Для целого ряда лекарственных препаратов назначение так называемых средних доз без учета знания концентрации препарата в крови может приводить к непредсказуемым последствиям. Изменение концентрации лекарственного препарата в крови может быть вызвано взаимодействием с другими препаратами, пищей, депонированием в тканях, изменением метаболизма.

В связи с этим, своевременная информация об изменении концентрации лекарственного препарата в крови или в других жидких биологических пробах позволит лечащему врачу скорректировать терапевтическое лечение.

Терапевтический лекарственный мониторинг необходим в следующих ситуациях:

  • при значительной межиндивидуальный вариации фармакокинетических параметров препарата, приводящей к существенным различиям в конкретных значениях стационарных концентраций в крови пациента (особенно важно внимательно относиться к фармакотерапии у детей, у которых имеются существенные различия в массе тела и скорости метаболизма, нельзя не учитывать и половые различия);
  • при нелинейной кинетике препарата, когда нет прямой зависимости между дозой препарата и концентрацией препарата в крови в пределах терапевтического уровня;
  • при очень узком терапевтическом коридоре (опасность получения нежелательных побочных и токсических проявлений);
  • при специфическом контингенте пациентов (беременные и кормящие женщины, лица пожилого возраста, грудные дети и т.д.), у которых фармакокинетические параметры, а значит, и границы безопасного терапевтического коридора, значительно отличаются от обычных известных средних значений;
  • при нарушениях функции почек, печени или желудочно-кишечного тракта, влияющих на фармакокинетические параметры;
  • при политерапии, когда нельзя исключить взаимовлияния нескольких препаратов и трудно смоделировать процессы, приводящие к нормализации фармакокинетических параметров;
  • при сомнении в регулярности приема препарата пациентом.

Основным способом регистрации фармакокинетики и проведения терапевтического лекарственного мониторинга является масс-спектрометрия – наиболее совершенный в настоящее время метод анализа состава вещества. Масс-спектрометры обладают высокой чувствительностью, динамическим диапазоном и разрешением. Это позволяет проводить, например, анализ примесей при их относительном содержании менее 10-9, определять элементный и изотопный состав пробы с большой точностью.

Применение масс-спектрометрии в биохимии и затем в медицине, бурно развивающееся в последние два десятилетия, привело к революции в этих науках, а создание нового масс-спектрометрического метода анализа сложных биоорганических соединений посредством десорбции ионов из органической матрицы импульсным лазерным излучением (МАЛДИ) было отмечено Нобелевской премией по химии за 2002 год.

Важнейшей проблемой масс-спектрометрии сложных органических соединений является способ их ионизации, который должен обладать не только высокой эффективностью, но и селективностью по классам соединений и не приводить к существенной фрагментации анализируемых соединений.

На разработку способов ионизации органических соединений были затрачены значительные усилия, однако из всего их многообразия только два реально обеспечили возможность анализа жидкостей и используются в современных масс-спектрометрических комплексах:

  1. образование ионов при распылении раствора анализируемого соединения в электрическом поле (электроспрей);
  2. десорбция ионов из органической матрицы лазерным излучением (МАЛДИ).

При существенных технических различиях основы этих способов близки и заключаются в захвате протона молекулой органического соединения с образованием протонированного иона M+H+ (здесь М - молекула анализируемого вещества). В большинстве случаев энергия, полученная органической молекулой при таком способе ионизации, оказывается недостаточной для ее сильной фрагментации и в масс-спектре наблюдаются в основном протонированные ионы анализируемых соединений.

Схема ионизации способом электроспрей

Схема ионизации способом электроспрей

Схема ионизации способом десорбции ионов из органической матрицы лазерным излучением (МАЛДИ)

Схема ионизации способом десорбции ионов

Схема ионизации новым способом SALDI

Схема ионизации новым способом SALDI

SALDI: Surface Assisted Laser Desobtion Ionization, лазерная десорбция-ионизация при помощи поверхности

Анализируемая проба наносится на специально подготовленную поверхность кремния или углерода с последующей лазерной десорбцией ионов органических соединений и их масс-спектрометрическим анализом. Поскольку ионизация способом САЛДИ осуществляется в вакуумной камере масс-спектрометра и не сопровождается потерями аналитических ионов (характерно для ионизации электроспреем), общая чувствительность способа САЛДИ оказывается существенно выше, чем у электроспрея.

Ключевую роль для получения высокой эффективности ионизации САЛДИ играет способ приготовления активной поверхности. Как показали исследования для эффективной ионизации САЛДИ необходимо создать в приповерхностном слое исходно монокристаллической подложки высокую (более 1017 в см3) плотность структурных дефектов типа «оборванных связей». Именно эти дефекты являются эффективными акцепторами электронов, генерируемых при лазерном облучении поверхности, что и приводит к принципиальному изменению энергетики химической реакции передачи протона анализируемой молекуле на поверхности.

Лазерная десорбция ионов с шероховатых поверхностей (SALDI)

Лазерная десорбция ионов с  шероховатых поверхностей

SEM и AFM изображения SALDI активных поверхностей

SEM и AFM изображения SALDI активных поверхностей

A – Аморфный кремний (РФ патент № 2285253, 2006)
B – Паровое травление Si (РФ патент №2007144944)
C – Анодное травление Si (РФ патент № 2217840, 2003)

САЛДИ масс-спектр следов тринитротолуола в воздухе

САЛДИ масс-спектр следов тринитротолуола в воздухе

Достигнутый предел обнаружения составил 10 ppt. Это соответствует относительной концентрации тринитротолуола в атмосферном воздухе 10-11.
ppt – particles per trillion, одна молекула на 1012 молекул воздуха.

Интерфейс ввода пробы в масс-спектрометр SALDI

Для анализа жидких биологических проб способом САЛДИ разработан и создан специальный интерфейс ввода пробы в масс-спектрометр. При атмосферном давлении жидкая проба наносится на активную кремниевую поверхность, расположенную на вращающемся шаре. После поворота шара на 180° проба вводится в масс-спектрометр. Под действием лазерного излучения проба десорбируется и ионизуется. При этом важно, что лазерное излучение очищает и активирует поверхность, после чего она готова к нанесению новой пробы. В связи с тем, что камера, в которой вращается шар, оснащена уплотнениями, при вводе пробы в масс-спектрометр САЛДИ падения вакуума практически не происходит и для обеспечения функционирования прибора достаточно вакуумных насосов относительно невысокой мощности (производительность форвакуумного насоса – около 0,7 литров в секунду, производительность вакуумного насоса – около 200 литров в секунду).

Интерфейс ввода жидкостной биологической пробы в масс-спектрометр SALDI

Интерфейс ввода жидкостной биологической пробы в масс-спектрометр SALDI

Традиционный ввод жидкостной пробы методом электроспрей

Традиционный ввод жидкостной пробы методом электроспрей

При вводе жидкой пробы способом электроспрей камера не герметична. В связи с этим для работы такого масс-спектрометра требуются вакуумные насосы существенно большей мощности (производительность форвакуумного насоса – около 5 литров в секунду, производительность вакуумных насосов – около 250 и 500 литров в секунду).

Оптическая схема масс-спектрометра SALDI

Оптическая схема  масс-спектрометра SALDI

Сканирование лазерного луча ООО «Номатех» г. Томск

Сканирование лазерного луча ООО «Номатех»
г. Томск

Лазер Nd:YAG с диодной накачкой и преобразованием частоты ООО «ЭЛС -94» г. Москва

  • Длительность импульса 0.35 нс
  • Частота повторения 500 Гц
  • Энергия в импульсе (355 нм) - 80 мкДж

Mасс-анализатор – рефлектрон с ортогональным вводом ионов

Mасс-анализатор – рефлектрон с ортогональным вводом ионов
  • Диапазон регистрируемых масс m = 1-10000 Да;
  • Разрешение по массам m/Δm = 6000;
  • Точность определения массы δm 10-5m;

Основные применения прибора для экспресс-анализа жидких биологических проб в медицине (терапевтический лекарственный мониторинг)

  • барбитураты – фенобарбитал;
  • производные бензодиазепина – диазепам, фенозепам, нитразепам, тофизопам;
  • иминостильбены – карбамазепин;
  • блокаторы кальциевых каналов – верапамил;
  • бета-адреноблокаторы – атенолол, метопролол, небиволол, пропранолол;
  • антиаритмические препараты – аймалин, лидокаин, прокаинамид.

Tofisopam (Грандаксин)

Tofisopam (Грандаксин)

 

Нанесение вещества электроспреем MW 382

  • Концентр. раствора 1 мкг/мл
  • Поток растворителя 1 мкл/мин
  • Поток вещества 1 нг/мин
  • Время экспозиции 2 сек
  • Нанесенное вещество 30 пг
  • Выход ионов за скан 800 000 (25 и/фг)

Chloropyramine (Супрастин)

Chloropyramine (Супрастин) Chloropyramine (Супрастин)

140 пикограмм в пробе (термоспрей)
291 аем – 500 000 ионов
246 аем - 5.5 106 ионов
~50 ионов/фг

Carbamazepine в сыворотке крови

Carbamazepine в сыворотке крови

Преимущества масс-спектрометра SALDI

При регистрации фармакокинетики реализуются следующие преимущества способа САЛДИ:

  • порог обнаружения по соединениям группы амфетаминов и тофизопаму – 0,1 пикограмм определяемого вещества в пробе, вводимой в прибор;
  • высокая скорость детектирования – до 1 мин. на одну пробу;
  • малый объем испытуемого образца – 1-10 мкл;
  • возможность одновременного определения концентраций до 20 веществ в одной пробе.

Использование нового метода ионизации САЛДИ позволяет построить более простой, чувствительный и универсальный масс-спектрометр по сравнению с имеющимися на рынке зарубежными аналогами для анализа жидких биологических образцов и проведения лекарственного мониторинга.

Сравнительная таблица аналогов

Показатели Разрабатываемый лазерный масс-спектрометр Q-TOF Ultima
Компания Waters
США
Орбитрэп Exactive
Компания Thermo Fisher
США
Ultraflex III
Компания Bruker
США
Год выхода на рынок - 2001 2007 2005
Метод ионизации пробы Лазерная десорбция САЛДИ Электроспрей Электроспрей Лазерная десорбция MALDI
Предел обнаружения вещества в пробе, пико грамм 0.1-1 200 10 1
Объем пробы, микролитр 1-10 10-100 10-100 1
Тип масс-анализатора Времяпролетный с ортогональным вводом ионов Времяпролетный с ортогональным вводом ионов Ионная ловушка Времяпролетный
Время анализа, минут 1 3-30 3-30 20
Ввод пробы САЛДИ интерфейс ВЭЖХ ВЭЖХ МАЛДИ технология

Все проекты направления "Лазерные технологии"